Guanidinoacétate (GAA) et créatine (Cr) sont des marqueurs biochimiques des syndromes de déficit en Cr (SDC). Nous décrivons une méthode de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC/MSMS) pour la détermination simultanée de GAA, Cr et créatinine (Crn). L'incorporation de Cr dans les fibroblastes pour la confirmation diagnostique du déficit en transporteur de la Cr est également étudiée. La séparation chromatographique des trois composés butylés et l'utilisation d'étalons internes marqués permet leur quantification par LC/MSMS en mode électrospray positif. La technique est linéaire de 0 à 600, 675 et 4 500 μmol/L et la limite de quantification est de 0,1 ; 0,04 et 0,9 μmol/L pour GAA, Cr et Crn respectivement. La répétabilité et la fidélité intermédiaire présentent un coefficient de variation < 11 %. Les taux de récupération des surcharges sont compris entre 83 et 109 %. Les valeurs de référence dans le liquide céphalorachidien de sujets ≥ 14 ans ont été établies pour GAA et Cr. Cinq lignées de fibroblastes ont été utilisées pour l'étude de l'incorporation de Cr. Celle-ci augmente avec la concentration en Cr dans le milieu de culture et est diminuée par un inhibiteur du transporteur de la Cr (3-guanidinopropionate, 500 μmol/L) (96 h d'incubation ; [Cr dans le milieu] = 25 μmol/L ; p < 0,05). Le dosage de GAA, Cr et Crn par LC/MSMS pour le diagnostic de SDC proposé est fiable et s'applique à plusieurs milieux biologiques. Nous renforçons également l'intérêt de l'étude d'incorporation de la Cr pour le diagnostic de déficits en transporteur de la Cr.