Identification rapide des chromosomes par hybridation in situ d'oligonucléotides marqués et comparaison avec la méthode PRINS.
Auteurs : Coullin P1, Valent A, Barbounaki I, Candelier JJ, Pellestor F, Bernheim ANous proposons dans cette étude une méthode simple et rapide d'identification des centromères humains sur chromosomes métaphasiques et sur noyaux interphasiques basée sur l'hybridation in situ d'oligonucléotides marqués avec des fluorochromes (HISOMA). Nous avons essayé la méthode sur des préparations cytogénétiques issues d'une lignée hétéroploïde humaine et d'un clone hybride homme x hamster en utilisant un oligonucléotide spécifique de l'ADN α-satellite du chromosome 1. Trois versions de cet oligonucléotide ont été synthétisées et couplées en 5' avec 1, 4 ou 10 molécules de fluorescéine. L'intensité des signaux obtenus avec un quatruple marquage permet sans ambiguïté de détecter la présence du chromosome et d'établir son degré de ploidie en utilisant un microscope classique de cytogénétique et sans avoir recours à un système d'amplification. La méthode s'est révélée être également efficace sur des coupes histologiques réalisées au cryostat. L'usage de fluorochromes différents ou de combinaison de fluorochromes, et une éventuelle stabilisation de l'hybridation de l'oligonucléotide par une courte élongation neutre permettent d'envisager la mise au point d'une méthode simple de marquage multicouleurs. Une première quantification des signaux obtenus par HISOMA et la comparaison avec ceux obtenus par primed in situ labelling (PRINS) en utilisant ces mêmes oligonucléotides comme amorces suggèrent que la longueur moyenne de l'élongation générée par la méthode PRINS serait très inférieure à ce qui est obtenu par PCR en phase liquide. Cette limitation de l'élongation in situ pourrait expliquer l'extrême difficulté rencontrée actuellement pour obtenir des signaux par les méthodes PRINS ou multiPRINS en utilisant des amorces spécifiques de séquences uniques.