La 5'nucléotidase ou 5'ribonucléotide phosphohydrolase (EC 3.1.3.5) est une phosphomonoester hydrolase hydrolysant spécifiquement la liaison monoester entre l'hydroxyle en 5' du ribose (ou du désoxyribose) et le groupement phosphate du nucléotide. L'activité 5'nucléotidase est présente dans de nombreux tissus. C'est une protéine principalement membranaire. Dans le foie, elle est localisée au niveau de la membrane des cellules épithéliales des canalicules biliaires et des sinusoïdes centrolobulaires et libérée dans le sang au cours d'affections hépatobiliaires d'origine cholestatique. Dans ce type d'affections, l'augmentation de son activité dans le sérum s'accompagne généralement d'une élévation simultanée de la phosphatase alcaline (PAL). La spécificité hépatique de la 5'nucléotidase lui confère une valeur discriminante face à une hyperphosphatasémie qui peut être d'origine hépatique, osseuse, placentaire ou intestinale. La mesure de son activité dans le sérum trouve son intérêt, en pédiatrie, en médecine adulte, au cours de la grossesse et en cancérologie. Sa détermination est utile au diagnostic de cholestase, à la recherche de métastases hépatiques, à la détection et au suivi des atteintes hépatobiliaires secondaires aux greffes de moelle osseuse.